Національна академія наук україни інститут фізіології ім. О. О. Богомольця



Сторінка3/8
Дата конвертації18.06.2017
Розмір1.34 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8

РОЗДІЛ 3
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
3.1. Морфологічні характеристики культивованих клітин людини лінії 4BL в умовах зниженого парціального тиску кисню та додавання донора сірководню
Морфологічних відмінностей між клітинами лінії 4BL людини контрольної (при Po2 159 мм рт. ст., що еквівалентно 21% О2) та дослідних груп, що піддавалися впливу зниженого Po2 у двох режимах – безперервного 24-х год (при Po2 23, 38 і 76 мм рт. ст., що еквівалентно 3, 5 і 10% О2) і переривчастого по 8 год/добу, 3 доби (при Po2 38 і 76 мм рт. ст., що еквівалентно 5 і 10% О2) – не виявлено (приклад представлено на рис. 3.1.1).

Клітини даної лінії були більш-менш однорідні за розмірами (60-120 мкм) та мали округле ядро. Під світловим мікроскопом переважна більшість клітин лінії 4BL людини мала витягнену веретеноподібну форму з відростками, але зустрічались і трикутні клітини. При низькій щільності клітин у популяції на третю добу культивування переважали фібробластоподібні клітини. Зустрічались круглі клітини, які відкріплювались від поверхні чашки Петрі та переходили у суспензію для поділу. Така морфологічна неоднорідність характерна для ММСК. Відносно фібробластів у культурі це пояснюють динамікою морфології клітин протягом клітинного циклу [76]. Попередніми дослідженнями встановлено, що клітини лінії 4BL мають властивості ММСК: здатні диференціюватися в остеогенному, адипогенному та міогенному напрямках у відповідь на дію відповідних стимулів [31-32, 39, 119].


А Б




х 400 12-7 х400 12-2

Рис. 3.1.1. Клітини лінії 4BL людини на 4-ту добу культивування у контролі (А) та при 24-годинному Po2 76 мм рт. ст. (Б). Фарбування за Романовським-Гімзою. Зб. ×100 та ×400


У результаті культивування МСК лінії 4BL людини у присутності донора сірководню NаHS ми вперше спостерігали значні морфологічні відмінності. Клітини контрольної групи характеризувалися фібробластоподібною формою (довжиною 50-120 мкм) з округлим ядром (рис. 3.1.2, а; рис. 3.1.3, а). Вони мали відростки, за допомогою яких контактували між собою з утворенням сітки. З невисокою частотою зустрічались подібні до трикутника більш розпластані МСК, або округлі клітини, які відкріплювались від поверхні та переходили у суспензію. У деяких зразках у культурі з’являлися клітини-гіганти (200 мкм). Клітини дослідженої культури при підвищенні конфлюентності схильні до подовження, стоншення та набуття щільного моношару.
8-2 х100 9-1

а б
10-7 11-1

в г
Рис. 3.1.2. Морфологія клітин лінії 4BL контрольної групи (а) та після впливу різних концентрацій NaHS: 10-8 М (б), 10-9 М (в), 10-10 М (г) на 3-тю добу культивування. Фарбування за Романовським-Гімзою. Зб. ×100
На третю добу культивування МСК у присутності NаHS (10-8-10-10 М) клітини набували атипової форми (рис. 3.1.2, б, в, г). Вони втрачали відростки та округлювалися. Розташовувалися поодиноко або невеликими групами з 4-8 клітин. На четверту добу − вирізнялися плоскі веретеноподібні клітини з довгими відростками, які контактували з поверхнею сусідніх клітин (рис. 3.1.3, б, в, г). Вони утворювали ділянки моношару з 10-20 клітин. Половина клітин морфологічно залишалась округлої форми.
12-43 13-5

а б
13-8 14 х100

в г
Рис. 3.1.3. Морфологія клітин лінії 4BL контрольної групи (а) та після впливу різних концентрацій NaHS: 10-8 М (б), 10-9 М (в), 10-10 М (г) на 4-ту добу культивування. Фарбування за Романовським-Гімзою. Зб. ×100
Зміну морфології клітин при додаванні у живильне середовище донора сірководню можна пояснити цитотоксичною дією Н2S [83, 182]. Наші дослідження показали, що у присутності мінімальної дози 10-15 моль/л NaHS приблизно 80-90% популяції клітин мали типову фібробластоподібну форму, іноді зустрічались ниткоподібні, атипові округлі та розпластані клітини-гіганти (>200 мкм). Можливо NaHS спричиняв би менш виражений цитотоксичний вплив при додаванні його до культури адгезованих клітин, аніж при внесенні безпосередньо під час пасажування, коли більшість клітин є неприкріпленими до субстрату та округлими.
3.2. Вплив 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на клітини лінії 4BL людини
Мезенхімальні стромальні (стовбурові) клітини людини знаходяться в кістковому мозку, жировій тканині, шкірі, тканинах серця, плаценті, пуповинній крові, а також в інших органах і тканинах [67, 115, 143, 184]. У культурі МСК мають здатність до активної проліферації. Наступна стадія розвитку – спонтанна диференціація in vitro в клітини кісткової (остеогенні клітини), жирової (адипоцити), хрящової (хондроцити), м'язової (міоцити) або сполучної тканини (фібробласти) [26]. Умови культивування (склад культурального середовища, фактори росту, індуктори диференціювання) відіграють важливу роль у реалізації функціональних можливостей клітин. Показано, що парціальний тиск кисню в позаклітинному середовищі, який зумовлює внутрішньоклітинну концентрацію кисню, також є одним з істотних факторів, що активно впливає на проліферацію, життєздатність, диференціювання, а також на морфологічні та імунофенотипічні показники клітин [5, 11-13, 15]. Проте їхні висновки неоднозначні. Це може бути пов’язано з вибором культури клітин, а також умовами проведення експерименту, а саме: використанням різного часового режиму та неоднакової інтенсивності впливу газової суміші.

Тому ми дослідили 24-годинний вплив зниженого Ро2 до 23, 38 і 76 мм рт. ст. на проліферацію, активність лужної фосфатази (один із маркерних показників початку остеогенної диференціації та показник інтенсивності метаболізму), концентрацію загального білку і зміни амінокислотного складу культуральної рідини МСК лінії 4BL людини.


3.2.1. Проліферація клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню
Результати проведених нами досліджень показали, що проліферація клітин лінії 4BL у газовій суміші з 3% О2 та в умовах стандартної атмосфери (СА) істотно відрізняються (рис. 3.2.1.1).


N•103, клітин/мл




1

групи

Рис. 3.2.1.1. Проліферація клітин лінії 4BL людини у контрольних (К, К1) і дослідних (І – 3%, ІІ – 5%, ІІІ – 10% О2, 24 год) груп на третю добу культивування. *р<0,05 – відносно контролю


На третю добу культивування після 24-х годинного безперервного впливу 3% О2 кількість клітин була у 2 рази нижчою порівняно з контролем. Чисельність клітин при 5 і 10% кисню вірогідно не змінювалась порівняно з контролем. Через 96 годин культивування при СА в середньому на чашках Петрі налічувалось 313 – 327 тис клітин/мл. При інкубуванні клітин у газових середовищах з 5% та 10% О2 спостерігали тенденцію до збільшення кількості клітин: 330 – 363 тис клітин/мл порівняно з контролем (рис. 3.2.1.2). У І-й групі налічувалось на 37% клітин менше (р<0,05) щодо контрольних значень.


N•103, клітин/мл




1

групи

Рис. 3.2.1.2. Проліферація клітин лінії 4BL людини у контрольних (К, К1) і дослідних (І – 3%, ІІ – 5%, ІІІ – 10% О2, 24 год) груп на четверту добу культивування. *р<0,05 – вірогідні відмінності показників порівняно з контролем


Відомо, що вирощування ММСК при знижених концентраціях кисню у середовищі інкубування (5-10% О2) може позитивно впливати на їхній проліферативний потенціал [5, 13, 21, 49]. Зміни проліферації клітин в умовах дозованої гіпоксії пов’язують із регуляторним впливом транскрипційного фактору HIF. Активація HIF-1α є універсальною відповіддю клітин на гіпоксію і виявлена у різних типах клітин [21, 214, 221].

Наші досліди показали, що 24-годинне культивування МСК лінії 4BL людини при 3% О2 призводило до зниження проліферативного потенціалу на 37% порівняно з контролем. На відмінність, при інкубації клітин в умовах 5 та 10% О2, не тільки не виявлено пригнічення проліферації, а навпаки – спостерігалась тенденція до стимулювання поділу клітин лінії 4BL, хоча статистично вірогідних змін кількості клітин у цьому експерименті не спостерігали.


3.2.2. Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню
Одним із показників стану клітин в умовах in vitro може бути їхня метаболічна активність. Концентрація загального білку у безклітинному культуральному середовищі на третю добу культивування після безперервного 24-х годинного впливу у І-й і ІІ-й дослідних пробах була вищою на 14% (р<0,05), а при 10% О2 – на 35% порівняно з контролем (рис. 3.2.2.1, а).


групи

Рис. 3.2.2.1. Концентрація загального білку у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини у контрольних (К) та дослідних (І – 3% О2, ІІ – 5% О2, ІІІ – 10% О2) груп на третю (а) та четверту (б) добу культивування після безперервного 24-х годинного впливу. *р<0,05 – статистична вірогідність порівняно з контролем

На четверту добу спостерігали статистично вірогідне зростання концентрації білку (на 36%) при 10% О2, а у інших досліджуваних пробах цей показник практично не відрізнявся від значень контролю (рис. 3.2.2.1, б). За нашими даними зниження вмісту кисню у газовому середовищі інкубації до 10% позитивно впливає на проліферативну та метаболічну активність мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин людини.

Відомо, що лужна фосфатаза (ЛФ) – фермент з групи гідролаз, що здійснює дефосфорилювання, тобто відщеплення фосфату (PO43-) від молекул різних органічних речовин (амінокислот, вуглеводів, нуклеотидів, білків). Біологічна роль її пов’язана з участю в обміні вуглеводів, фосфоліпідів, ДНК і РНК. Рівень її вмісту в організмі слугує надійним показником інтенсивності метаболізму [23]. ММСК лінії 4BL людини можуть диференціюватися в остеобласти, що в організмі формують нові елементи кісткової тканини. Для цього в культуральній рідині вимірювали активність ЛФ, яка є також одним із маркерних показників початку остеогенної диференціації мезенхімальних клітин [50]. Згідно з отриманими нами даними, на третю добу культивування клітин при 3% О2 активність ЛФ вірогідно знизилась на 40%, при 5% О2 – на 20% і при 10% О2 – на 23% порівняно з контрольним значенням (рис. 3.2.2.2, а). На четверту добу спостерігали спадання активності ЛФ у І-й і ІІ-й групах на 60% (р<0,05), а у ІІІ-й групі цей показник практично не відрізнявся від контролю (рис. 3.2.2.2, б). Отримані нами дані узгоджуються з опублікованими раніше результатами експериментального дослідження Грінаковської О.С. і співавт. [18]. Автори цього дослідження показали, що мезенхімальні стромальні клітини з ліпоаспірату людини (лМСК), які культивувались при 5% О2, утворювали в середньому на 50% менше мінералізованого матриксу у відповідь на остеогенну індукцію, ніж у стандартних умовах (21% О2). Після перенесення лМСК, постійно культивованих при 5% О2, у нормоксичні умови (21% О2) вони синтезували стільки ж матриксу, що і лМСК, постійно культивовані при 21% О2. Автори прийшли до висновку, що умови гіпоксії уповільнюють комітування лМСК під впливом остеогенних стимулів, що може мати вагоме значення при вирішенні задач відновлювальної та регенеративної медицини [18].



групи

Рис. 3.2.2.2. Активність лужної фосфатази у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини у контрольних (К) та дослідних (І – 3%, ІІ – 5%, ІІІ – 10% О2) груп на третю (а) та четверту (б) добу культивування. *р<0,05 – статистична вірогідність порівняно з контролем


Встановлено, що у молодих щурів, які знаходились у стані гіпокінезії, але дихали штучною газовою сумішшю зі зниженим Ро2 91±8 мм рт. ст. протягом 28 діб, активність ЛФ у сироватці крові залишалася близькою до контрольних значень, а у кістковій тканині мала тенденцію до зниження порівняно з контролем. Це можна розглядати як підтвердження пригнічення процесів фізіологічного відновлення кісткової тканини при гіпокінезії. У тварин, що дихали газовою сумішшю 45 діб при обмеженні рухливості, активність ЛФ у сироватці крові вірогідно (р<0,05) знизилась у 1,5 раза порівняно з конролем. Водночас активність ЛФ у кістковій тканині молодих щурів вірогідно підвищилась, що свідчить на користь нормалізуючого впливу гіпоксії саногенного рівня за умов гіпокінезії [35-38].

При співставленні показників активності ЛФ, концентрації загального білку та проліферативного потенціалу клітин лінії 4BL, були встановлені їх кореляційні зв’язки (рис. 3.2.2.3).


А Б
Рис. 3.2.2.3. Графічна демонстрація ступеня кореляційних зв’язків між активністю лужної фосфатази та проліферацією клітин лінії 4BL людини (А) і між концентрацією загального білку у культуральній рідині та проліферацією (Б) при 24-годинній дії зниженого парціального тиску кисню 23, 38 і 76 мм рт. ст.


Зокрема, спостерігалась низька позитивна кореляція (r=0,24) між активністю ЛФ та проліферацією клітин. Негативний низький кореляційний зв’язок (r=-0,26) був встановлений між показниками концентрації загального білку і проліферацією. Виявили, що вказані чинники не корелюють між собою, тому не можуть використовуватись у якості додаткових факторів оцінки впливу зниженого парціального тиску кисню.

Отже, в наших дослідах після 24-годинного впливу зниженого Ро2 23 і 38 мм рт. ст., на четверту добу культивування спостерігали спадання активності ЛФ у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини на 60% у обох групах. Це може свідчити про гальмування інтенсивності метаболізму та диференціації в остеогенному напрямку. При цьому концентрація загального білку залишалась на рівні контролю. Після 24-годинного впливу зниженого Ро2 76 мм рт. ст. концентрація загального білку в культуральній рідині досліджуваної лінії статистично вірогідно зростала на 36%, проте активність ЛФ практично не відрізнялась від значень контролю. Отримані результати вказують, що Ро2 може регулювати як ферментативну, так і біосинтетичну активність клітин.


3.2.3. Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню
На наступному етапі нашої роботи ми виявили, що безперервний 24-годинний гіпоксичний вплив призводив до змін амінокислотного складу культуральної рідини клітин лінії 4BL людини за показниками концентрації 13-ти фракцій вільних амінокислот (АК).

Результати проведених досліджень показали, що концентрація вільних АК гліцину (дефіцит призводить до порушення структури сполучної тканини) і метіоніну у культуральній рідині при дії 10% О2 на третю добу культивування була вищою на 85% (р<0,05) порівняно з контролем, а при 3 та 5% О2 – не відрізнялась від контрольних значень (рис. 3.2.3.1, А). На четверту добу культивування, цей показник зріс лише на 9% у 3-й групі (рис. 3.2.3.1, Б). Концентрація АК у 1-й і 2-й дослідних групах за той же період була вірогідно більшою на 60 і 47% відповідно порівнюючи з контрольним зразком (рис. 3.2.3.1, Б).



С, %

*

*

*

групи

А Б
Рис. 3.2.3.1. Концентрація гліцину і метіоніну у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К – 21% О2) і дослідних (І – 3% О2, ІІ – 5% О2, ІІІ – 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 – вірогідність порівняно з контролем


У процесі культивування МСК лінії 4BL людини в умовах 24-х годинного зниження Ро2 (38 і 76 мм рт. ст.) на третю добу концентрація проліну (основний елемент колагену) і оксипроліну майже не змінювалася відносно контролю. Вірогідно нижчою на 17% (р<0,05) концентрація цієї фракції була у 1-й групі (рис. 3.2.3.2, А). На четверту добу культивування їх вміст знизився в усіх дослідних групах: у 1-й на 31%, у 2-й – 42%, у 3-й – 21% (рис. 3.2.3.2, Б). Оскільки пролін і оксипролін являються головними АК у первинній структурі колагену, можна зробити припущення, що вони включалися у синтез даного білка.


*

*

*

*

групи

С, %

А Б
Рис. 3.2.3.2. Концентрація проліну і оксипроліну у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К – 21% О2) і дослідних (І – 3% О2, ІІ – 5% О2, ІІІ – 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 – вірогідність порівняно з контролем

Отримані нами результати узгоджуються з літературними даними інших дослідників, які показали, що введення в зону перелому трубчастої кістки щурів мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин кісткового мозку, культивованих при 5% кисню сприяло збільшенню коефіцієнта потовщення кісткової мозолі і хрящової тканини [11, 15].

Вміст вільних АК серину і аспарагінової кислоти у культуральній рідині був меншим на третю добу культивування при 3% кисню на 17%, а при 5% О2 – на 18% порівняно з контрольним значенням (рис. 3.2.3.3, А). При 10% О2 концентрація цих амінокислот вірогідно зростала на 19%. На четверту добу культивування у 1-й і 2-й пробах вміст серину і аспарагінової кислоти вірогідно (р<0,05) знизився на 45% і 62% відповідно порівнюючи з контролем (рис. 3.2.3.3, Б).



С, %




*

*

*

*

*

групи

А Б
Рис. 3.2.3.3. Концентрація серину і аспарагінової кислоти у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К – 21% О2) і дослідних (І – 3% О2, ІІ – 5% О2, ІІІ – 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 – вірогідність порівняно з контролем


Концентрація вільного аланіну (бере участь у синтезі колагену) і глутаміну у культуральній рідині на 3-тю добу вирощування клітин у всіх зразках вірогідно не відрізнялась від значень контролю, хоча при 3 і 5% кисню мала тенденцію до зростання (рис. 3.2.3.4, А). Рівень цих АК через 96 год культивування збільшувався у 1-й і 2-й групі на 19 та 23% (р<0,05) відповідно, і зменшувався у 3-й групі – на 12% порівняно з контролем (рис. 3.2.3.4, Б).


С, %




*

*

*

групи

А Б
Рис. 3.2.3.4. Концентрація аланіну і глутаміну у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К – 21% О2) і дослідних (І – 3% О2, ІІ – 5% О2, ІІІ – 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 – вірогідність порівняно з контролем


Фракції дев’яти інших АК змінювались з часом культивування по-різному. Газова суміш зі зниженим Ро2 (23 мм рт. ст.), яку подавали у безперервному режимі 24 год, сприяла вірогідному (р<0,05) зменшенню концентрації вільних амінокислот 4-х фракцій, а саме: цистеїну і цистину на 29%, валіну і триптофану – 33%, треоніну і ізоваліну – 22%, ізолейцину – 38% порівняно з контролем на 4-ту добу культивування (табл. 3.2.3.1).
Таблиця 3.2.3.1

Безперервний вплив зниженого парціального тиску кисню (23 мм рт. ст., що еквівалентно 3% О2, 24 год) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)




Показники

Контроль

(3-тя доба)



3% О2

(3-тя доба)



Δ, %

Контроль

(4-та доба)



3% О2

(4-та доба)



Δ, %

цистеїн, цистин

0,41±0,04

0,42±0,05

+2

0,38±0,03

0,27±0,02*

-29

аргінін, гістидин, таурин

1,24±0,05

1,44±0,07*

+16

1,40±0,12

1,96±0,09*

+40

лізин, аспарагін

2,77±0,22

2,59±0,12

-6

2,92±0,11

3,44±0,14*

+18

валін, триптофан

0,59±0,03

0,52±0,02*

-12

0,61±0,03

0,41±0,02*

-33

тирозин, глутамінова к-та

4,34±0,26

3,85±0,24

-11

4,80±0,23

5,74±0,24*

+20

треонін, ізовалін

2,02±0,13

2,04±0,12

+1

1,67±0,08

1,30±0,06*

-22

лейцин

1,19±0,07

1,22±0,06

+3

1,06±0,07

0,94±0,06

-11

фенілаланін

0,61±0,04

0,72±0,08

+18

0,49±0,02

0,63±0,15

+29

ізолейцин

0,14±0,02

0,13±0,02

-7

0,13±0,04

0,08±0,02

-38


Поділіться з Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8


База даних захищена авторським правом ©divovo.in.ua 2017
звернутися до адміністрації

войти | регистрация
    Головна сторінка


загрузить материал