Національна академія наук україни інститут фізіології ім. О. О. Богомольця



Сторінка2/8
Дата конвертації18.06.2017
Розмір1.34 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8

Примітка: стандартно атмосферний тиск дорівнює 760 мм рт. ст., жирним шрифтом виділено газотрансмітери.


У порівнянні з іншими газовими трансмітерами H2S має більш високу розчинність у воді і має високу ліпофільність, тому легко проникає через плазматичну мембрану клітини. Переміщається в цитоплазмі за рахунок дифузії і циклозіса, взаємодіє безпосередньо з внутрішньоклітинними ферментами [46]. Сірководень зв'язується з залізом в гемі цитохром с-оксидази, яка при цьому втрачає активність. В результаті − зупиняється окисне фосфорилювання в мітохондріях і порушується клітинне дихання.

Сірководень продукується ендогенно в різних тканинах тварин і людини за допомогою трьох ферментів: цистатіонін-β-синтази та цистатіонін-γ-ліази, що відповідають за метаболізм L-цистеїну, а також 3-меркаптопіруватсульфуртрансферази [216]. У різних органах і тканинах фізіологічні концентрації сірководню варіюють і становлять від 1 до 100 нмоль/г тканини. У плазмі крові щурів фізіологічна концентрація сірководню становить 46 мкМ, а в тканинах мозку 50-100 мкМ [206]. Цистатіонін-β-синтаза в основному діє в центральній нервовій системі, а цистатіонін-γ-ліаза − у клітинах гладкої мускулатури судинної стінки і в кардіоміоцитах. У печінці і в нирках працюють обидва фермента [53]. Один з основних механізмів дії газотрансмітерів − модифікація білків. NO модифікує сульфгідрильні групи, СО − залишки гістидину, а H2S відновлює дисульфідні зв'язки [57, 62, 190].

Як й інші газоподібні сигнальні молекули (NO і CO), сірководень в межах фізіологічних концентрацій релаксує гладенькі м'язи кровоносних судин, шлунково-кишкового тракту, репродуктивної і дихальної систем [127, 252-253]. Судинорозширювальну властивість сірководню виявив канадський дослідник Ван Жуй [53]. Він працював з лабораторними щурами, яким вводив у вену розчин гідросульфіду натрію (NaHS) в межах фізіологічних концентрацій. Крім того, він проводив дослідження і на ізольованих артеріях щурів. У результаті введення NaHS судини розширювалися, а артеріальний тиск різко знижувався. Частота серцевих скорочень при цьому не змінювалася. Ван Жуй, блокуючи частину генома вивів лінію генетично-модифікованих мишей, позбавлених гена цистатіонін-γ-ліази. Усі мутантні миші, як гомозиготні, так і гетерозиготні, були цілком життєздатні, плідні і зовні не відрізнялись від тварин вихідного типу. Однак вміст сірководню в крові, серцевому м'язі і стінці аорти у гомозигот становив всього 20% від нормального рівня, а у гетерозигот − 50%. Рівень H2S у сироватці крові також був нижче норми. Разом із тим відсутність гена цистатіонін-γ-ліази не вплинула на рівень сірководню в тканинах мозку, де його синтез забезпечує цистатіонін-β-синтаза. З віком у мутантних мишей розвивалася гіпертонія. У дванадцятитижневих гомозиготних тварин тиск перевищував норму на 18 мм. рт. ст., тобто приблизно на 15%. Ін'єкція NaHS на деякий час знижувала кров'яний тиск, причому у мутантів сильніше, ніж у тварин вихідного типу. Мабуть у мутантних мишей знижується поріг чутливості до впливу сірководню [53, 246].

Відомо, що функції газотрансмітерів односпрямовані, але мішені і механізми їх дії відрізняються. NO і СО активно проникають у гладеньку мускулатуру кровоносних судин і активують фермент гуанілілциклазу. Це веде до утворення циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ), який запускає ланцюг реакцій, що приводить до розширення судин [28]. Сірководень гіперполяризує мембрану, що забезпечується активністю КАТФ-каналів [56, 68, 85]. При введенні блокаторів АТФ-чутливих калієвих каналів вазодилятація пригнічувалась [103, 253]. Селективний інгібітор КАТФ-каналів − глібенкламід − зменшує холінергічну гіперполяризацію гладеньких м'язових клітин (ГМК) брижових артерій приблизно на 70%, але не впливає на вазодилятаторну дію донорів оксиду азоту [190]. У серцево-судинній системі сірководень пригнічує проліферацію ГМК, модулюючи МАР-кіназний сигнальний шлях [175]. Cірководень може викликати і скорочення сегментів аорти щура через зміну внутрішньоклітинної концентрації циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) або активацію Cl/НСО3 обмінника й ацидифікацію цитоплазми ГМК [167].

Вазоактивні ефекти H2S мають істотне значення для підтримки рівня артеріального тиску. Гідросульфід натрію можна розглядати, як дійсне джерело газотрансмітера, а низький рівень ендогенного H2S у крові, як патогенетичний фактор розвитку гіпертонічної хвороби, ішемічно-реперфузійних ураженнях життєво важливих органів [6, 235].

H2S впливає на судинний тонус усіх класів хребетних тварин (риб, амфібій, рептилій) і включає як вазоконстрикцію, так і вазодилятацію, що вказує на філогенетичну давнину H2S як газомедіатора і універсальність його дії [62, 162-164, 205].

Встановлено, що гліальні клітини головного мозку також мають здатність синтезувати сірководень. Він бере участь у регуляції кислотно-лужного гомеостазису нервової тканини. На відміну від нейронів, що передають сигнали шляхом генерації потенціалів дії, гліальні клітини «спілкуються» одна з іншою і нейронами шляхом регуляції кальцієвих потоків в мозку. Показано, що H2S суттєво впливає на концентрацію іонів кальцію, генеруючи так звані «кальцієві» хвилі в астроцитах і нейронах [16, 133].

Показано також, що сірководень сприяв проліферації і диференціації нейрональних стовбурових клітин гіпокампа миші C57BL/6 після гіпоксії. Тварини (вік − 1 день) зазнавали впливу гіпоксичної газової суміші (5% кисню в азоті) протягом 2-ох годин. Внутрішньоочеревинно вводили NaHS (56 мкмоль/кг/день) протягом 30 днів. Результати дослідження показали збільшення кількості проліферативних клітин у зубчастій звивині гіпокампу мишей після 2-годинного дихання газовою сумішшю з парціальним тиском кисню 38 мм рт. ст. [178].

До захисних ефектів, які спостерігаються при дії сірководню на мітохондрії, можуть бути частково залучені мітохондріальні АТФ-залежні К+-канали [65-66]. Встановлено концентраційну залежність впливу NаHS на набрякання мітохондрій, ізольованих із тканини серця щурів. Низькі концентрації (10-12-10-8 моль/л) збільшували набрякання органел, а фізіологічні (10-6-5•10-5 моль/л) – здійснювали протекторний ефект щодо кальційіндукованого набрякання мітохондрій серця щурів [65].

Важливо також зазначити, що мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку синтезують H2S з метою регулювання їх самооновлення і остеогенної диференціації. Дефіцит H2S призводив до дефектів кісткової тканини (остеопороз) миші [179]. Крім того було показано, що сірководень (0,1 нг/мл H2S, 9 днів) стимулював диференціацію МСК кісткового мозку людини і МСК пульпи зуба у гепатоцитарному напрямку. Накопичення глікогену і синтез сечовини автори вважали маркерними показниками перетворення МСК у гепатоцити [197]. Інші дослідження виявили зниження проліферації фібробластів серця людини на 33-58% через гальмування активності К+-каналів при концентрації NaHS 100-500 µM. Також, виявлено зменшення їх диференціювання у бік міофібробластів [215].

Сірководень спричиняє цілий ряд ефектів, включаючи вазодилятацію, кардіопротекцію, регуляцію проліферації та апоптозу, ангіогенез, тому роль H2S на процеси життєдіяльності клітин потрібно розглянути більш детально.
1.4.1. Роль сірководню в регуляції апоптозу клітин
Для підтримки тривалої працездатності будь-якого органу абсолютно необхідне його постійне ремоделювання – заміна клітин на нові. Апоптоз варто розглядати як елемент фізіологічної підтримки клітинного гомеостазису. Він усуває старі або функціонально неповноцінні клітини. Порушення реалізації запрограмованої загибелі клітин є одним із патогенетичних факторів розвитку захворювань. До них відносяться серцево-судинні та нейродегенеративні захворювання, гострі та хронічні запальні процеси, цукровий діабет, злоякісні новоутворення та ін Це обумовлює актуальність досліджень, присвячених встановленню молекулярних механізмів дизрегуляціі апоптозу. Встановлено, що H2S може спричиняти як індукуючий, так і інгібуючий вплив на механізми реалізації апоптозу клітин [64, 78, 83].

Дослідження впливу донора сульфіду водню (NaHS) на апоптотичну загибель клітин лінії Jurkat (T-лімфобластна лейкемія) і мононуклеарних лейкоцитів, отриманих від здорових донорів показали, що H2S посилював апоптотичну загибель клітин після 15 хв інкубації in vitro в концентраціях 10 і 100 ммоль (до 9,70% і 13,20% відповідно) у порівнянні з контролем (4,45%) [47, 63]. Виявилося, що H2S може запускати запрограмовану загибель клітин із залученням мітохондріального шляху індукції апоптозу, активацією каспази 3 і родини МАР-кіназ [78, 83, 208]. Показано, що вплив на клітини Т-лімфобластної лейкемії NaHS протягом 24 год не призводить до змін запрограмованої клітинної смерті. Проапоптотичний ефект сульфіду водню у високих мілімолярних концентраціях супроводжується генерацією активних форм кисню, зниженням вмісту глутатіону та залученням як рецепторного (Fas-опосередкованого), так і мітохондріального шляхів реалізації апоптозу [158]. Показано також, що дія більш низьких (мілі- і мікромолярних) концентрацій газу може призводити до цитопротекторного (антинекротичного і антиапоптотичного) або проапоптотичного ефекту в залежності від типу клітин та умов експерименту [172].

Ендогенний або екзогенний сірководень здатний регулювати проліферацію клітин. Giuliana Gobbi і співавтори показали, що екзогенний сірководень знижує клональний ріст, проліферацію і клітинну адгезію кератиноцитів людини in vitro. На молекулярному рівні H2S знижує Raf / MAPK (mitogen-activated protein kinase) / ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) сигнальних шляхів. Зниження адгезії в оброблених гідросульфідом натрію клітин (2 mM NaHS, 24-48 год) пов'язані з пригніченням експресії β4, α2 і α6 інтегринів, які необхідні для сприяння клітинної адгезії, а також антиапоптоза і проліферативної сигналізації нормальних кератиноцитів [136]. H2S може викликати пошкодження ДНК і тим самим змінювати клітинний цикл у різних клітинах ссавців. Дослідження показують, що H2S проявляє проапоптотичну дію. Наприклад, Yang G. і співавтори показали, що ендогенний H2S викликає апоптоз гладких м'язових клітин аорти людини через шлях MAP кінази [244-246]. Останнім часом повідомлялося, що NaHS (10 mM, 3 год) може індукувати апоптоз ацинарних клітин підшлункової залози миші через мітохондріальний шлях [92]. Було показано, що сірководень викликає ушкодження ДНК і змінює експресію генів апоптозу в легеневих фібробластах організму людини [83]. У цьому дослідженні, легеневі фібробласти людини культивували з донором сірководню NaHS (10-75 mM, 12-48 год). NaHS підвищував експресію генів ku 70 і ku 80, але не впливав на експресію генів інших репаративних білків, таких як ядерний антиген проліферуючих клітин (PCNA) або реплікаційний білок А (rNase protection assay). Вплив сірководню на адгезію клітин, життєздатність, проліферацію, активацію та секрецію цитокінів досліджено на різних типах клітин (лімфоцитах, макрофагах, фібробластах, кератиноцитах, гладком'язових клітинах, міобластах, ендотеліальних клітинах, ракових клітинах товстої кишки й епітеліальних клітинах кишечника і т.д .) [83, 245, 250].

Таким чином, газовий трансмітер − сульфід водню − здатний здійснювати модулюючий ефект на проліферацію і на запрограмовану загибель клітин. Кінцевий ефект впливу H2S на апоптоз визначається типом досліджуваних клітин, а також концентрацією і часом впливу газового трансмітера на клітини.


1.4.2. Роль сірководню у цитопротекції
Велика кількість досліджень свідчить про кардіопротекторну дію H2S при інфаркті міокарда і гіпоксії. При інфаркті порушується кровопостачання серця через ураження коронарних артерій, що супроводжується розвитком некрозу в міокарді. Після експериментально викликаного інфаркту міокарда у щурів H2S знижував розмір області некрозу і зменшував смертність тварин. Автори вважають, що судинорозширювальна дія H2S посилює коронарний кровоток при ішемічних станах і знижує клітинне пошкодження. Кардіопротекторний ефект H2S базується на активації АТФ-залежних калієвих каналів [62]. Крім того, є дані про стимуляцію сірководнем ангіогенезу − утворення нових кровоносних судин за рахунок посиленої міграції ендотеліальних клітин [123].

Показано, що позаклітинна сигнальна регуляторна кіназа і фосфатидилінозитол-3-кіназа беруть участь у H2S-SP-індукованої кардіопротекції при ішемії в кардіоміоцитах щурів. Введення NaHS значно знижувало частоту виникнення інфаркту міокарда, а також підвищувало скоротливу функцію ізольованого серця щура. Життєздатність клітин і відсоток паличковидних кардіоміоцитів залежать від концентрації NaHS і знаходяться в межах від 1 до 100 мкмоль/л [151].

У експериментах на перфузованих за методом Лангендорфа серцях щурів вивчали ефекти донора сірководню гідросульфіду натрію на зміни функціонального стану, резервні можливості серця та його реакцію на ішемію-реперфузію (20хв/40хв). Показано, що внутрішньоочеревинне введення щурам NaHS у дозі 7,4 мг/кг супроводжувалося збільшенням функціональних резервів серця. Кут підйому кривої кінцево-діастолічного тиску у них був меншим, а плато кривої Франка-Старлінга − тривалішим. NaHS збільшував мембранний потенціал мітохондрій серця, але не впливав на експресію гена UCP3. Ступінь відновлення показників кардіодинаміки після 20-хвилинної ішемії на тлі застосування NaHS був істотно вищим, ніж у контрольній серії внаслідок зменшення утворення мітохондріальних пор. Зроблено висновок, що донор сірководню у досліджуваній дозі має кардіопротекторний ефект [57, 73].

Відомості про роль різних типів К+АТФ-каналів у реалізації кардіопротекторного ефекту сірководню досить суперечливі. Bian і співавт. [86] виявили, що блокування К+АТФ-каналів сарколеми знімало ефект введення сірководню, а внутрішньовенне застосування специфічного блокатора мітохондріальних К+АТФ-каналів 5-гідроксидеканоату (5-HD) не впливало на розмір інфаркту ішемізованого серця. Sivarajah і співавт. [219] дійшли висновку, що Н2S не мав захисного впливу на міокард при внутрішньовенному застосуванні 5-HD. Згідно з даними Струтинської та співавт. [65], преінкубація ізольованих мітохондрій серця з 5-HD викликала ослаблення протекторного ефекту донора сірководню відносно кальційіндукованого відкривання мітохондріальних пор. Це може свідчити про участь мітохондріальних К+АТФ-каналів у Н2S-залежному інгібуванні пороутворення в серці, що спостерігається при його реперфузії [65].

Сірководень в мікромолярних концентраціях, отриманий in vitro з Na2S або NaHS [238, 243], виявляє цитопротекторні властивості, які можуть бути пов'язані з його здатністю нейтралізувати активні форми молекул (наприклад, пероксинітрити, гіпохлоритну кислоту і гомоцистеїн). H2S модулює функціонування внутрішньоклітинних каспаз або кіназ (p-38, c-JUN N-термінал протеїнкіназа 1/2, ERK1/2, PI3K), активацією ядерного фактору − кВ і кВ-залежних протеїнів (індуцибельна NO-синтаза, циклоокисигеназа-2, міжклітинна адгезивна молекула-1), а також зі зниженням антиапоптотичного фактору Bcl-2 [226]. Показано, що пригнічення ендогенного синтезу сірководню збільшує цитотоксичну дію на клітини організму екзогенного H2S [46]. Встановлено, що для захисту тканин нирки від ушкодження при ішемії−реперфузії необхідний ендогенний H2S. Введення NaHS зменшує ступінь виникнення дисфункцій і морфологічних змін нирок [226].

Найбільш загальним ефектом дії ендогенного H2S є вазодилятація. Показано, що в центральній нервовій системі ендогенний сірководень функціонує як нейромодулятор, але може виконувати і протекторну функцію при оксидативному стресі або порушеннях кровопостачання мозку. Відомо, що відновлений глутатіон виконує роль одного з основних антиоксидативних протекторів мозку. Підвищення фізіологічного рівня синтезу сірководню в мозку збільшує вміст глутатіону, що захищає нейрони від апоптозу в умовах оксидативного стресу, що запускається підвищеним рівнем L-глутамату [165]. Донор H2S (100 µM NaHS) здійснював цитопротекторний вплив на первинну культуру ембріональних щурячих нейронів при використанні моделі окиснювального стресу, індукованого глутаматом (1 mM, 2 год). Газотрансміттер підвищував внутрішньоклітинну концентрацію антиоксиданту глутатіону через активацію експресії γ-глутамілцистеїнсинтази [165].

Внутрішньоклітинні газові трансмітери необхідні для фізіологічного функціонування практично всіх органів і тканин. Сірководень продукується багатьма клітинами організму. Це свідчить про те, що в процесі еволюції H2S виявився важливим елементом спочатку гуморальної, а потім і нейрогенної регуляції життєвих властивостей − проліферації, фізіологічної регенерації й апоптозу. Фізіологічні концентрації ендогенного H2S забезпечують церебро- і кардіопротекцію, відносно постійний артеріальний тиск, зберігаючи здоров'я людини і тварин у складних динамічних умовах зовнішнього середовища. Проте роль Н2S в мінімальних концентраціях на життєздатність і метаболізм МСК лінії 4BL людини не досліджувалась.

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Умови культивування соматичних клітин людини лінії 4BL
Для вирощування клітин лінії 4BL використовували середовище Ігла у модифікації Дюльбекко (DMEM − Dulbecco΄s modified Eagle΄s medium) (“Sigma”, США) із додаванням 100 ОД/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 10% ембріональної сироватки теляти (“Sigma”, США). Клітини культивували при 37 °С у скляних чашках Петрі (d=35 мм). Контрольні клітини тримали в стандартних умовах СО2-інкубатора: 5% СО2 і 95% повітря (21% О2).

Клітинна лінія 4BL – це мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини, одержані з периферичної крові здорового донора і переведені в умови стандартної моношарової культури. Лінію клітин 4BL отримано і досліджено у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України [31-32, 39].

У наших дослідженнях для культивування клітин лінії 4BL людини газову суміш зі зниженим (відносно атмосферного повітря) парціальним тиском кисню (Ро2) подавали в двох режимах – безперервному і переривчастому (табл. 2.1.1). Мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини лінії 4BL зазнавали впливу зниженого Ро2 в переривчастому режимі: 8 годин деоксигенація і 16 годин реоксигенація протягом 3-х діб. У безперервному режимі клітини інкубувались у газових сумішах 24 години, а потім переносились у СО2-інкубатор без змін поживного середовища. У кожному варіанті досліда по 12 чашок Петрі. Загальна тривалість експерименту становила 4 доби (96 годин).

Таблиця 2.1.1

Схема експерименту




досліду

Група

Умови культивування

клітин лінії 4BL людини (n=12)

І

Контроль

Стандартні умови СО2-інкубатора: 5% СО2 і 95% повітря (Ро2 159 мм рт.ст.)




ІІ

Вплив зниженого Ро2

24 год безперервно


22-23 мм рт.ст. (3% О2, 5% СО2, 92% N2)

37-38 мм рт.ст. (5% О2, 5% СО2, 90% N2)

75-76 мм рт.ст. (10% О2, 5% СО2, 85% N2)



ІІІ

Вплив зниженого Ро2 переривчасто

8 год/добу×3 дні=24 год



37-38 мм рт.ст. (5% О2, 5% СО2, 90% N2)

75-76 мм рт.ст. (10% О2, 5% СО2, 85% N2)



IV

Вплив донора сірководню NаHS

10-8 М

10-9 М

10-10 М

10-12 М

10-13 М

10-15 М



V

Cумісний вплив

Ро2 (24 год безперервно)

+ NаHS

22-23 мм рт.ст. +10-12 М NаHS

37-38 мм рт.ст. +10-12 М NаHS

Донором сірководню був гідросульфід натрію (NaHS, “Sigma”, США).


2.2. Оцінка проліферації клітин у культурі
Для визначення проліферації клітини досліджуваної лінії висівали по 50 тис. клітин на чашку Петрі і додавали по 2 мл живильного середовища. Клітини знімали за допомогою суміші 0,25% трипсину і 0,02% ЕДТА (рН 7,5; 1:1) на третю (72 год) й четверту (96 год) добу культивування. Підраховували їхню кількість у лічильній камері Горяєва [70] під світловим мікроскопом у 15-20 полях зору для оцінки середнього арифметичного.

Морфологічні зміни оцінювали візуально під світловим мікроскопом Jenaval (“Carl Zeiss”, Німеччина). Знімки отримували за допомогою фотоапарата Canon PowerShot 640А, приєднаного до мікроскопу. МСК фіксували і фарбували за методом Романовського-Гімзи.


2.3. Визначення концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини
Концентрацію загального білку в культуральній рідині визначали за допомогою біуретового методу [19].

Принцип методу: оснований на утворенні забарвленого у фіолетовий колір комплексу пептидних зв’язків білка з іонами двовалентної міді (сульфату міді) в лужному середовищі. Інтенсивність забарвлення розчину прямопропорційна концентрації білку і визначається фотометрично.

Реагенти:

Біуретовий реактив (СuSO4, KNaC4H4O6 i NaOH).

До 0,1 мл культуральної рідини добавили 5 мл робочого розчину біуретового реактиву, уникаючи утворення піни. Через 30 хвилин виміряли екстинцію на фотометрі в кюветі з товщиною шару 1 см при довжині хвилі 540 нм (зелений світофільтр) проти біуретового реактиву. Розрахунок проводили по калібровочному графіку. Калібровочний графік будували використовуючи серію стандартних розчинів курячого білку різної концентрації.

Формула розрахунку:

Ед / Ест × 5 = мг/мл, де

Ед – екстинція дослідної проби;

Ест – екстинція стандартної проби.
2.4. Визначення активності лужної фосфатази в культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини
Використовували стандартний набір реактивів ("Філісіт-Діагностика", Україна).

Принцип методу: лужна фосфатаза (ЛФ) розщеплює фенілфосфат при рН 10,4 з утворенням фенолу та фосфату, відповідно до наступної реакції:

фенілфосфат + H2O ЛФ фенол + фосфат.

Окисне сполучення фенолу з 4-амінофеназоном утворює червоний барвник, інтенсивність забарвлення якого визначається фотометрично. Активність ферменту є пропорційною прирощенню оптичної щільності розчину.

Реагенти:


  1. Буферний концентрат:

  • карбонат натрію – 32,0 г/л,

  • бікарбонат натрію – 16,8 г/л,

  • 4-амінофеназон – 10,2 г/л.

  1. Субстрат: дінатрійфенілфосфат – 64 мг.

  2. Окислювач: періодат натрію 50 г/л.

  3. Калібрувальний розчин фенолу – 2,5 ммоль/л.

До контрольної і дослідної пробірки додавали по 2,1 мл субстратно-буферного розчину. Потім у дослідну пробірку вносили 0,07 мл культуральної рідини, перемішували та інкубували 10 хвилин при 37ºС. Після чого додавали в обидві пробірки по 2,1 мл окисного розчину. У контрольну пробу додавали ще 0,07 мл культуральної рідини. Витримували 5 хвилин при кімнатній температурі і вимірювали оптичну щільність дослідної проби (А) проти контрольної проби при λ=540 нм, І=10 мм.

Активність ферменту у пробі розраховували за формулою:

А (проби) = К × Е (проби),

де К – коефіцієнт, вирахуваний по калібрувальному графіку,

Е (проби) – оптична щільність дослідної проби, виміряна проти відповідної контрольної проби.

Перерахунок одиниць робили з урахуванням того, що 1 кат/л = 1 моль/с•л, або 1 мккат/л = 60 МО/л.


2.5. Визначення концентрації вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини
До 1 мл культуральної рідини додавали 2 мл спирт-ацетона (1:3), перемішували і через 30 хв центрифугували (10 хв при 3 000 хв-1). Супернатант випарювали до 1 мл і наносили на хроматографічний папір "FN" (Німеччина) по 20 мкл. Амінокислоти розділяли на 13 фракцій:

  1. цистеїн, цистин (Cys);

  2. аргінін, гістидин, таурин (Arg+His+Taurine);

  3. лізин, аспарагін (Lys+Asn);

  4. гліцин, метіонін (Gly+Met);

  5. серин, аспарагінова к-та (Ser+Asp);

  6. аланін, глутамін (Ala+Gln);

  7. валін, триптофан (Val+Trp);

  8. тирозин, глутамінова к-та (Tyr+Glu);

  9. треонін, ізовалін (Thr+Isovaline);

  10. пролін, оксипролін (Pro+Hyp);

  11. лейцин (Leu);

  12. фенілаланін (Phe);

  13. ізолейцин (Ile).

Для розгонки використовували систему розчинників, яка включала ізоаміловий спирт, бутиловий спирт, оцтову кислоту, мурашину кислоту та воду (9:7:4:2:5 по об’єму) [24, 29].

Після видалення хроматограм із розчинника під витяжною шафою, їх фарбували за допомогою скляного лабораторного обприскувача розчином нінгідрину. Для кількісної оцінки амінокислотного складу використовували вітчизняний денситометр ДО-1М.


2.6. Методи статистичної обробки результатів
Отримані в експериментах цифрові показники обробляли статистично з використанням критерію t Стьюдента. Визначали середнє арифметичне (М), стандартну похибку (m), коефіцієнт вірогідних змін по Стьюденту (р). Нормальність розподілу даних аналізували тестом Колмогорова-Смирнова. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними серіями досліду при р<0,05. Статистичну обробку здійснювали за допомогою програмного забезпечення OriginPro 7,5 та програми Microsoft Excell 2003. Кореляційний аналіз проводили із встановленням лінійного коефіцієнта кореляції Пірсона (r), що змінюється в межах від -1 до +1 [42].

Поділіться з Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8


База даних захищена авторським правом ©divovo.in.ua 2017
звернутися до адміністрації

войти | регистрация
    Головна сторінка


загрузить материал